HPLC和LC/MS 緩沖液選擇指南：控制pH值
由于離子化化合物的保留對流動相pH非常敏感，因此需要添加緩沖液來控制流動相的pH值。
當(dāng)添加少量酸或堿時，緩沖液會保持pH值。HPLC緩沖液中使用了許多不同的物質(zhì)；部分添加劑會在表1中列出。
在pKa值上下浮動1個pH單位內(nèi)使用時，緩沖液是最有效的；在pKa值上下浮動2個pH單位時，也可提供足夠的緩沖。
表1. 常見的流動相添加劑1的pKa值
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pKa (25°C) |
化合物 |
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0.3 2.15 3.13 3.75 4.76 4.76 4.86 6.35 6.40 7.20 8.06 9.23 9.25 9.78 10.33 10.72 11.27 12.33 |
三氟乙酸2 磷酸(pK1) 檸檬酸(pK1) 甲酸 醋酸 檸檬酸(pK2) 丙酸 碳酸(pK1) 檸檬酸(pK3) 磷酸(pK2) 三異丙基乙磺酰 硼酸 氨 甘氨酸(pK2) 碳酸(pK2) 三乙胺 吡咯烷3 磷酸(pK3) |
HPLC紫外檢測最常用的緩沖液是磷酸鹽和醋酸鹽。
磷酸鹽和醋酸鹽是非常有用的緩沖液，因為它們可以在低于220nm的波長下使用。
從表2可以看出，磷酸鹽具有三個pKa值，可提供如下三個緩沖范圍：1.1<pH<3.1，6.2<pH<8.2和11.3<pH<13.3（pKa可上下浮動1個pH單位）。
由于色譜柱的穩(wěn)定性在實際使用時存在限制因素，我們需要將較低范圍截斷至2.0<pH <3.1，并消除最高范圍。
請注意，磷酸鹽的緩沖作用在pH為3.1和pH為6.2之間存在一個缺口。
這意味著，雖然可以將磷酸鹽的pH值調(diào)節(jié)至5.0，但這個pH值下的緩沖能力可以忽略不計。
為了填補這個緩沖缺口，就需要另一種緩沖液。
由于醋酸鹽的緩沖范圍為3.8<pH<5.8，因此它剛好可以填補這一缺口。
如果略微擴展pKa的緩沖范圍（上下浮動1個pH單位），磷酸鹽和醋酸鹽便可以覆蓋通常用于硅基色譜柱的整個pH范圍，即2<pH<8。
有時在方法開發(fā)過程中，您可能希望在色譜柱的有效范圍內(nèi)完全控制pH值。
在這種情況下，磷酸鹽和和醋酸鹽混合物可使流動相在2<pH<8的范圍內(nèi)連續(xù)變化。
一旦發(fā)現(xiàn)所需的pH值，就可以去掉不需要的緩沖液。
例如，如果最終流動相的pH值是4.3，那么醋酸鹽就是所需的緩沖液，根本無需使用磷酸鹽。
部分分析人員喜歡使用檸檬酸鹽，因為它具有三個重疊的pKa值，可在2.1<pH<6.4的范圍內(nèi)提供緩沖（表2）。
但是，檸檬酸鹽并不像醋酸鹽和磷酸鹽那樣具有較低的紫外截止波長，所以它無法在220nm以下的波長環(huán)境下工作。
此外，一些分析人員發(fā)現(xiàn)，在使用檸檬酸鹽時，止回閥會出現(xiàn)更多的問題。
因此，檸檬酸鹽緩沖液通常是位于磷酸鹽和醋酸鹽之后的第二選擇。
表2. 常見的HPLC緩沖液
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緩沖液 |
pH范圍 |
LC-MS 兼容性 |
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磷酸鹽(pK1) 磷酸鹽(pK2) 磷酸鹽(pK3) 醋酸鹽1 檸檬酸鹽(pK1) 檸檬酸鹽(pK2) 檸檬酸鹽(pK3) 三氟乙酸(0.1%) 磷酸(0.1%) 甲酸(0.1%) 甲酸銨 碳酸氫銨 硼酸鹽 |
1.1 – 3.1 6.2 – 8.2 11.3 – 13.3 3.8 – 5.8 2.1 – 4.1 3.7 – 5.7 4.4 – 6.4 2.0 2.0 2.7 2.7 – 4.7 6.6 – 8.6 8.3 -10.3 |
X X X 是 X X X 是 X 是 是 是 是 |
